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        DNA/DNA(雜交)同源性測定



        錄入時間:2020-5-25 10:07:36 來源:青島海博生物

        (一)菌體收集和DNA提取

         

          同“DNA的G+C含量測定”部分。

         

        (二)DNA/DNA同源性測定方法

         

          現介紹應用較多的兩種:

          1.復性率方法:

           (1)DNA樣品處理:用溶菌酶或SDS等破壁提取的DNA絲狀溶解物,實驗前需先置冰浴中用超聲波50 W超聲4次,每次15 s,間隔1-2min,使DNA片段在2~5 x 105dalton;用超聲破壁提取的DNA溶液,不再做超聲處理。

           (2)DNA變性:將剪切過的待測DNA樣品(A、B)分別用O.lSSC精確配制成OD260為1.5或2.0(約50 μg/0D);取樣品A、B各3 ml分別裝在兩支中試管里,再取A,B各1.5ml裝在同一支試管中混勻為樣品M。A、B、M三個樣品測試前分別置沸水浴中變性10 min,用預熱的1 ml吸管吸預熱的lOSSC O72 ml加入上述變性樣品中,稍加混勻,使最終濃度為2SSC。

           (3)測定DNA的復性速率:①開機和選擇測量條件,打開分光光度計,待儀器校正后,選擇時間掃描,固定260 nm波長,選擇3 mm/min的掃描 速度自動控制時間,并使記錄紙上的量程放大2-2.5倍。②預熱比色架和比色杯(裝有2SSC)。用半導體點溫計通過熱敏電阻探頭監視杯中溶液的溫度,使其穩定在指定的最適復性溫度(TOR)。③上樣:待達到TOR后,棄去比色杯中的2SSC溶液,迅速轉入變性DNA樣品液,同時接通熱敏電阻,觀察溫度。全部過程不得使樣品的溫度低千TOR。④測定復性率:待測試樣品的溫度達到TOR時,開始記錄相應的吸光度,以此為零時,隨后每隔5 min讀數一次,待反應進行到30 min時,停止掃描。最終得到一條隨時間延長、吸光值逐漸減小的直線。⑤計算復性速率:用零時的吸光度減去30 min時的吸光度,除以總時間(30 min),得出直線的斜率, 即DNA的復性速率(通常用V表示單位為每分鐘吸光值的減少值)。 每個樣品需重復測試2~3次。計算:
           0min~30min的吸收值/30min=V(復性率

           4Vm-(Va-Vb)/2√VaVb X 100

           Va、Vb和Vm分別表示A、B樣品和M為混合樣品的復性速率。

         

          2.固相分子雜交方法

           (1)制膜:取0.2 mlDNA溶液(含量約為10 μg/0D),加入蒸熘水至2.5 ml,于lOO℃變性10 min,轉入冰浴,加入預冷的12 X SSC 2.5 ml,減壓慢速濾過微孔膜(GSWP,孔徑0.22 μm,膜徑為25 mm,用前在蒸餾水和6XSSC中分別浸泡半小時),再以25 ml 6 x SSC抽濾洗膜(收集DNA的濾液,測其OD260,與濾前相比較,可求得吸附率),濾膜于室溫過夜,然后以不銹鋼打孔器刻得6 mm直徑的小膜,于80℃烘干4 h,最后放入真空干燥器內,4℃保存備用。

           (2)標記:取100 μg變性DNA溶液于0.1 mol/LNaAc-0.04 mol/LHAc (pH 5.0)溶液中,置冰浴,并依次加入KI (2.5 m mol/L水溶液),使終濃度為0.25 m mol/L;加Na125I 200-400 μCi混合,最后加入三氯化駝(6.5 X 10-2mol/LTiCl3水溶液),使其終濃度為6.5 X 10-3mol/L?偟姆磻w積為0.3-0.ml;旌衔镌60℃水浴中保溫20 min,冷卻加入新配制的0.1 mol/L NH4Ac-0.5 mol/LN比OH調pH至8.7, 60℃保溫20 min,冷卻。上Sephadex G50柱(32 x 1.5 cm),以重蒸餾水洗脫,并收集6~7管(2-3 ml/管)。每管取IOμl滴于小濾紙片,干燥,投入盛5 ml液閃液[0.4% 2, 5-二苯惡唑,0.01%1, 4-雙(苯基惡唑基-2)-苯的甲苯液]的測量瓶內,以NE 8312液閃測量儀測量放射性強度,同時用紫外分光光度計測量每管的OD260。其中皆高者為己標上125I的DNA溶液,置冰箱保存備用。

           (3)雜交:將6張載有變性DNA的小膜和1張對照的空白小膜一同置于瓶(直徑3 cm,高4.5 cm)內,加入2 ml Denhardt預溫液(3XSSC中含有0.02%菲可,0.02%聚乙烯吡咯烷酮和0.02%牛血清白蛋白), 加塞置37℃處理5 min,然后吸出預溫液。加入經4號針頭(2 ml針管)反復壓擠剪切15-20次的125I-DNA液,含標記DNA約3 μg,加入12SSC和2% SDS,使總反應體積約1 ml。 反應液的SSC的終濃度為2XSSC, SDS的濃度為0.1%。 塞緊塞子,置60℃水浴中反應15h,吸出反應液,用2XSSC在60℃下洗膜3次,干燥小膜,加5 ml液閃液,置液閃儀測置其放射性。

           (4)同源性百分數計算:以參考菌株標記的DNA與自身未標記的DNA雜交膜(簡稱同源膜)所測得脈沖數減去空白膜脈沖數,與參考菌株標記的DNA和測定菌株未標記的DNA雜交膜(簡稱異源膜)脈沖數也減去空白膜的脈沖數,然后二者相比,得出參考菌株和測定菌株之間的同源性分數。如公式所示:
           同源性%=(異源膜脈沖數-對照膜脈沖數)/(同源膜脈沖數-對照脈沖數) X100

           本文節選自《常見細菌系統鑒定手冊》第十五章。

         

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